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在分子生物学实验中，当研究人员历经艰辛从细胞中提取出珍贵的RNA后，所做的第一个关键步骤往往就是：将其溶解在DEPC水中。 此外，配制电泳缓冲液、稀释试剂乃至清洗实验器皿，都离不开它。 DEPC水可以为脆弱的RNA分子创造一个安全的环境，彻底清除无处不在的“RNA杀手”——RNase。 那么，DEPC水是如何抑制RNase的呢？ 什么是DEPC水DEPC是什么？ 它的中文全名是焦碳酸二乙酯，是一种非常活跃的有机化合物。在常温下，它呈无色液体状。 那么我们要如何制备呢？ 研究发现0.1%的DEPC即可起到抑制RNase的作用。 将0.1%（v/v）的DEPC加入水中。即比如在水中加入1mL的DEPC制备成1000mL的DEPC水，就可以制备DEPC水。 DEPC呈有机物状态，加入水中以后，无法与水马上相溶，需要充分混合。 通常可以用电动搅拌仪和搅拌子在室温搅拌数小时或过夜，让DEPC与水相溶，与潜在RNase充分反应。 最后，有一个至关重要的步骤：必须通过高温高压灭菌处理，以去除水中未反应的DEPC。因为DEPC本身也会破坏后续...

简单来说，动物组织的标准流程之所以能“先加裂解液后研磨”，是因为动物组织比植物组织“友好”得多。 植物细胞有坚硬的细胞壁植物细胞有坚固的纤维素细胞壁，物理上非常坚韧，需要极强的机械力（如液氮冷冻脆化后研磨）才能有效破碎。 动物细胞只有柔韧的细胞膜，没有细胞壁。在裂解液（通常含有去污剂如SDS）中，细胞膜会迅速被溶解。因此，对于小块动物组织，仅靠涡旋、匀浆器或珠磨的轻微机械力就足以完成破碎。 RNase含量和分布的差异植物组织：RNase不仅含量高，而且常储存在独立的区室中，如液泡、细胞壁。一旦机械破碎不彻底，这些区室破裂会持续释放RNase，而裂解液渗透需要时间，这就造成了RNA降解的“时间窗口”。 动物组织：而常用的实验组织（如肝、脑、肌肉等）本身的RNase活性相对较低。动物细胞的RNase没有储存在类似植物液泡那样坚固的区室里。当裂解液接触到组织时，它能更快、更均匀地渗透并失活所有RNase。 植物组织先液氮冷冻研磨，后加裂解液，主要是为了在裂解细胞、释放RNA之前，最大限度地抑制RNA酶（RNase）的活...

有多少人感觉病毒包装就是一个玄学，为啥别人次次成功，而自己做经常滴度低，感染效率不理想？ 首先让我们看看影响病毒包装的因素 病毒载体的选择慢病毒优点：它能把自己带的基因敲入细胞的基因组里，变成细胞基因组DNA的一部分。只要这个细胞活着并且分裂，外源的DNA就能一直表达下去。所以适合需要长期、稳定做研究的实验。 包装周期相对短点。 缺点：① 感染细胞的效率没那么高；② 它自己不能“繁殖”，所以病毒产量低、浓度（滴度）也低，通常需要先体外实验，不太够直接做动物注射。 腺病毒优点：感染效率高！而且纯化后能直接注射到动物体内。它还能体外“扩增”，一次能拿到很高浓度的病毒。 缺点：它不进基因组，只在细胞质里暂存，过一阵子就被细胞清除了。所以是短期（瞬时） 表达。 包装周期更长。 简单总结： 想做稳定细胞株，长期观察基因功能？选慢病毒。 想快速在体外或动物体内看到短期、强烈的效果？选腺病毒。病毒包装的步骤包装病毒是个精细活，成功与否取决于一串“流水线”上的每个环节： 细胞状态：用来包装病毒的“工厂”细胞必须健康。...

ddH₂O（双蒸水）定义：经过两次蒸馏得到的纯度很高的水。 特点：不含离子、杂质和有机物，但可能含有RNase（核糖核酸酶）。 风险：RNase非常稳定，无处不在（皮肤、灰尘、器皿上都有），它会降解RNA。 DEPC水属于RNase-Free Water定义：用DEPC（焦碳酸二乙酯）处理过的ddH₂O。 特点：不含RNase，DEPC能与RNase的活性基团反应，从而灭活RNase。 注意：DEPC本身有毒性，且会干扰生化反应。因此，商业购买的或自行处理的DEPC水，在灭活RNase后，必须通过高温高压灭菌来分解残留的DEPC，才能安全使用。 稀释cDNA用那一种水？建议用DEPC水 从RNA提取、反转录到qPCR，都应该在无RNase的环境中进行。使用DEPC水可以最大限度地避免意外引入RNase。 qPCR体系配制用哪一种水？建议用DEPC水 一方面，商业化的qPCR Mix都是无核酸酶的。用DEPC水去稀释和配制体系，能保证整个反应环境的纯洁，避免因水质问题导致酶失活或非特异性扩增。 另一方面，引物（尤其是基因特异性引物）是单链DNA寡...

简短的回答是：是的，需要确保质粒无菌。但是其实使用商业化的试剂盒，并不需要特意保证无菌环境，只要确保最后的洗脱液和ep管干净，就不会污染细胞。 为什么在普通实验台上操作，最终质粒却不污染细胞？01纯化柱可以去杂质质粒提取试剂盒（特别是无内毒素质粒提取试剂盒）的核心是吸附柱。在结合和洗涤步骤中，缓冲液的设计使得只有质粒DNA能高效地结合到膜上，其他蛋白质、代谢物、盐离子等杂质会被洗掉。 细菌碎片和内毒素在这些步骤中也被有效地去除了。 即使你在有菌环境下裂解细菌，这些污染物也不会被纯化柱捕获，而是在弃去的滤液和洗涤液中。 02乙醇洗脱虽然裂解、中和等前期步骤在非无菌环境下进行，但通常会用含有70%-80%乙醇的洗液洗涤。这个过程能进一步去除盐分和杂质，并且乙醇本身就有杀菌作用。洗涤后，可以保证最终收集到的质粒溶液是无菌的。 03耗材和溶菌液无菌经过前面一系列的洗涤纯化，纯化柱的膜上基本已经不含有其他杂质，接下来只要保证洗脱过程中的洗脱液和接触的耗材是干净的，提取的质粒就是无菌的。 好物推荐本篇文章来源于微信公众...

PD-1 /PD-L1是重要的免疫负调控分子，在生物体中负责维持免疫耐受，及时抑制免疫效应，防止免疫系统过度激活而攻击自身正常组织。 而在肿瘤免疫学研究领域，程序性死亡蛋白-1（PD-1）及其配体（PD-L1）组成的免疫检查点通路已成为调控T细胞应答的关键机制，直接破坏肿瘤的免疫逃逸机制。 PD-1和PD-L1简要介绍PD-1PD-1（Programmed cell death protein 1 ，CD279） 是一种关键的免疫检查点受体，主要表达于活化T细胞、B细胞和NK细胞等免疫细胞的表面。 它可以促进CD4T细胞分化成调节性T细胞。PD-1的生理功能是作为免疫反应的“刹车”，和配体PD-L1或PD-L2结合时，通过传递抑制性信号，限制免疫细胞的活化和功能，从而防止自身免疫反应并维持免疫耐受。 PD-L1PDL1 （Programmed Cell Death-Ligand 1，CD274）有多个结构域，是一种含有290个氨基酸的1型跨膜蛋白。PDL1被认为是PD1的主要受体， 可以通过顺式和反式和受体 PD1 结合，从而抑制抗肿瘤的 PD1+的T 细胞功能。在抗原呈递细胞、活化的T细胞以及...

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microRNA，也就是miRNA，是一类内源性的非编码小RNA分子，成熟的miRNA长度通常是21-23个核苷酸。它可以跟mRNA的3'UTR结合，抑制目的mRNA转录，或者导致它降解。 不过也有报道说有的miRNA会跟5'UTR相互作用。在动物体内，单个miRNA可识别多个mRNA靶标，一个mRNA靶标也可以被多个 miRNA识别，这个特性使得miRNA的研究极具困难。 miRNA在细胞增殖、分化、凋亡等多种生物学过程中扮演重要角色，miRNA表达异常与多种人类疾病的发生发展密切相关。 miRNA由来miRNA的生物合成始于由基因组DNA编码的初级转录本（pri-miRNA）。该转录本先后经过细胞核内Drosha酶复合物与细胞质Dicer酶的两次切割，最终在胞质生成成熟的miRNA单链。 值得注意的是，许多miRNA位于蛋白质编码基因的内含子区，这类miRNA与其宿主基因共享启动子等调控元件和初级转录本，因此通常表现出类似的表达模式。 图片出处：Thakore P, Delany AM. miRNA-based regulation in growth plate cartilage: mechanisms, targets, an...

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