在分子生物学实验中，做核酸电泳时不可避免地会接触到各种核酸染料。 然而，市面上大多数商业化的核酸凝胶染色试剂在安全性、稳定性和灵敏性方面总是难以全面满足实验需求。 EB（溴化乙锭）是曾经使用最广泛的核酸染料，具有诱变性，极易穿透细胞膜，与胞内DNA嵌合，对细胞造成损害。这种细胞毒性可能影响生殖细胞的正常功能，进而影响生育能力。 但是现在很多实验室还在用EB，无非三个原因，效果好、价格便宜，最后则是实验安全意识弱。 现在出现了很多EB替代品的核酸染料我们先看看SYBR Green I 和SYBR Gold ，很多人都认为它们最灵敏，但是但它们的稳定性却不尽如人意，导致染色效果时好时坏，难以信赖。 不得不说的就是Goldview，有些商家说Goldview比EB更安全，但是却避重就轻，已经有人实锤，它的主要成分是吖啶橙，同样具有强诱变。 那么，是否存在一种能够在安全性、稳定性和灵敏性三方面都表现出色的核酸染料呢？答案是肯定的——GelRed！ GelRed作为新一代的核酸电泳染料，凭借其高灵敏度、低毒性和卓越的稳定性脱颖而出，成为E...

你有没有见过实验室里放着一个工作的电磁炉，上面是铁锅装着沸腾的开水，里面还泡着一些ep管？ 做过wb的实验er应该都知道！这不是在做饭，而是在进行蛋白样本的处理。 Western Blot（WB）实验是最常用的蛋白检测技术，可以定性及半定量目的蛋白。在做WB实验的时候，跑胶之前，我们通常会把蛋白样本在95℃-100℃煮5分钟，离心后再进行上样  为什么蛋白上样前要先高温处理？ 1.  高温可以使蛋白质变性：在生物化学课程中，我们知道蛋白有复杂的立体结构：一级结构，二级结构，三级结构。这些复杂的立体结构会影响蛋白在凝胶电泳中的迁移速率。在wb实验中，我们需要让蛋白只按分子量大小分离，不能让三级结构对迁移率产生影响。高温处理可以使蛋白质发生变性，失去原有的立体结构，展开成线性的肽链。这样蛋白的空间结构就不会对电泳产生干扰。 2.  促进SDS与蛋白质结合：高温处理可以提高SDS与蛋白的结合率。SDS是变性蛋白电泳里的一个重要的组分，它可以使蛋白质带上负电荷，这样蛋白质原本的电荷将不再干扰迁移，电泳时就能够完全按照分子量大小进行...

火山图是一种很常见的数据表达方式，常见于展现RNA seq的差异表达基因结果，可以宏观地看到整体有多少基因上调表达，有多少基因下调表达。那么这些结果要怎么解读呢！           以上面的这个火山图为例，我们来解度一下这个数据的含义。这是一个RNA seq的差异表达结果图，每一个点都代表了一个基因。 01读懂纵坐标  所有坐标系的图，我们都必须先看懂坐标轴的含义。 我们可以先看看这个Y坐标轴，写的是-log10（adjusted P）。P value假设检验中的重要指标，adjusted P则是校正后的P value，这主要在多重检验里出现。 简单地说人话解释就是：做一次假设检验出现的犯错误的概率相对低，但是如果做了很多很多次假设检验，犯错误的概率就会提高，这时候就需要对p value进行校正。 只要是做了多重检验的实验，都要用校正后的p value来判断显著性。               所以这里的-log10（adjusted P），就是指对校正后的P值取10的对数的相反数。 假设取p小于0.01作为有显著性的界限，取10的对数的相反数以后，y=-log10（0.01）=2。 这是一个递减函数...

做wb应该选什么做内参？ 在Western Blot实验中，内参蛋白的选择对于实验结果的准确性和可靠性至关重要。内参蛋白通常是一些管家基因编码的蛋白，它们的表达比较相对恒定。我们可以通过观察内参蛋白的结果，来判断实验是否可信。 比如，目的蛋白没有条带，就可以看看内参基因，如果内参有条带就说明实验操作和样本是没问题的，可能是目的蛋白不表达，或者目的蛋白的抗体有问题。 比如，目的蛋白的条带很浅，但是内参蛋白条带已经很浓，说明可能是目的蛋白的表达比较少。 如果连内参蛋白都没有条带，就可能是实验操作有问题，比如转膜失败了，或者样本降解了。 内参蛋白的选择原则： 1.蛋白表达的稳定性：通常选择恒定表达的管家基因编码的蛋白，它们一般不会因为细胞的衰老、加药、基因敲除或者环境改变等问题影响表达。 2.分子量差异：内参蛋白的分子量不能跟目标蛋白的分子量太接近，否则可能会重叠在一起无法分辨。 3.细胞定位匹配：内参蛋白的亚细胞定位需要跟目标蛋白一致。例如，如果目标蛋白位于细胞核，应选择核蛋白内参（如Histone H3或Lamin B）；如果目...

细胞莫名死亡、转染效率忽高忽低、动物模型炎症频发......你的转染实验是否总在重复这些问题？可能你忽略了一个隐形杀手：内毒素。 内毒素是转染实验中的“沉默破坏者”，尤其对原代细胞、体内实验和精密研究堪称致命。 一内毒素是什么？内毒素（Endotoxin）是革兰氏阴性菌细胞壁的脂多糖（LPS）成分，在质粒提取过程中极易残留。 ● 主要来源：大肠杆菌宿主裂解释放（即使质粒纯化后仍可能残留） ● 检测标准：内毒素单位（EU/μg DNA），国际期刊要求＜0.1 EU/μg二含内毒素的实验室灾难1、细胞死亡：实验还没开始就结束了 典型现象： 转染后24-48小时细胞大量死亡（空泡化、贴壁脱落）、悬浮细胞聚集成团 2、转染效率跳水 ● 转染效率对比实验： 质粒类型 HEK293T（贴壁） 原代神经元 iPSC（干细胞） 普通质粒 60% ＜5% 10% 去内毒素质粒 85% 35% 65% ● 原因：内毒素与DNA竞争结合转染试剂（如脂质体），形成无效复合物 3、 实验数据忽高忽低、长期实验不可重复 ○ 使用普通质粒：Western Blot目标蛋白条带强度波动、荧光素酶报告基因...

问题一些小伙伴在首次使用RNA提取试剂盒，经常忘记往wash buffer加无水乙醇，然后实验就翻车了，大家有没有想过RNA提取试剂盒的wash buffer 为啥要加无水乙呢？回答在使用RNA提取试剂盒有一个重要的步骤，那就是柱清洗，通过Wash Buffer的洗涤，去除离心柱中可能残留的盐类、酶、蛋白质以及其他有机和无机杂质，确保提取的RNA纯度。 无水乙醇的加入可以增强wash buffer的洗涤能力，防止RNA在洗涤过程中再溶解到溶液中。 如果wash buffer中没有提前加入无水乙醇，会在洗涤的过程中将RNA冲下，无法正常留在膜上。 下一步加入elution buffer便无法正常洗脱RNA产物。最终导致RNA的损失和污染。本篇文章来源于微信公众号:信天翁GOONIE...