qPCR即通过PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测，从而实现对起始模板定量及定性的分析。那么忙活了一两天，好不容易做完了qPCR，如何才能判断数据能不能用呢？教大家从三个方面来判断。  省流版答案： 1、Ct值12~182、 2、熔解曲线: ①TM值在80-90之间 ②单峰无杂峰，且尖锐 ③峰距在5个TM内最优 3、扩增曲线: ①曲线具有平台期 ②Fluorescence至少在3以上 ③曲线无二次抬头一、看Ct值范围是否理想  Ct值是指阈值循环数，C代表Cycle（循环），t代表threshold（阈限）。 在PCR（聚合酶链式反应）检测中，DNA的复制都需要经过多个循环，每一个循环都会产生新的DNA。 而这个荧光信号，其实就是在每一个循环中，随着DNA的复制数量增加，其积累到一定程度时所发出的信号。这个信号会随着循环的增加而增强，直到达到设定的阈值，这个阈值就是阈限。 数据的代表含义： 如果一个样本中目的基因片段的浓度越高，那么在同样的时间内，DNA复制的数量就会越多，荧光信号达到阈值所需的循环数就越少。反之，如果目的基因的浓度越低，...

琼脂糖凝胶电泳是分子生物学实验室中分离鉴定核酸的常规方法，核酸是两性电解质，其等电点为pH2-2.5，在常规的电泳缓冲液中(pH约8.5)，核酸分子带负电荷，在电场中向正极移动。 通过电泳技术，可以分离出不同大小和构象的RNA分子，并通过观察条带的数量、大小和形态，可以判断出RNA分子的完整性。 而在这个过程中，电泳缓冲液的主要作用就是保持pH，并使溶液具有一定的导电性。 TAE和TBE是比较常用的缓冲液，它们到底有什么区别呢？ TAE缓冲液 制备办法：1X TAE缓冲液：40mMTris-acetate，1mMEDTA，pH 8.2 – 8.4（在25°C下）优点： ①对于大于13kb的DNA片段，TAE缓冲液能取得更好的分离效果。 ②在TAE缓冲液中，DNA的超螺旋状态在电泳过程中能够更好地保持其真实的相对分子质量。 ③适用于回收DNA片段，后续进行酶切反应等 缺点： 缓冲容量小，TAE缓冲液在长时间电泳过程中可能会逐渐失去其pH缓冲能力，导致pH值发生变化。 TBE缓冲液 制备办法：1XTBE: 89 mM Tris,89mM boric acid,2 mM EDTA PH...

A260/A280、A260/A230比值偏低，主要的原因就是酚残留，别急着把样本丢弃，大可不必从头再来，下面教大家如何重新洗涤沉淀，得出理想的RNA纯度。 方法一： 如果是用Trizol提取RNA，最后得出来的OD值比较低，可以重新吸附、洗涤，注意是直接洗涤两次，之后离心时可以两次将 EP 管置于不同的方向，便于溶液中的各个部分都能得到充分的洗涤。 方法二： 加入0.1倍体积的3M sodium acetate以及3倍体积的冰乙醇，将混合物置于-80℃下冷藏过夜，第二天离心，之后再使用75%的冰乙醇洗涤沉淀物。 具体操作步骤： ①在不纯的RNA样本中加入0.1倍体积的3M 醋酸钠、2.5~3倍体积冰上预冷的无水乙醇（100%），旋涡充分混合。 ②在-20℃下沉淀1小时或过夜，又或者在-80℃下沉淀一小时（如果RNA量很少，过夜放置可以产生更多沉淀）。 ③4℃下最高速离心（13000rpm）30分钟 ④用0.5 mL冰上预冷的75%乙醇洗涤RNA沉淀两次，每次在4℃下离心10分钟 ⑤去除乙醇，吸走大部分乙醇后，可以快速离心（最高速度离心10秒），尽可能去除剩余的乙醇。 ⑥风干沉淀并重悬于...

以信天翁的qPCR试剂盒为例，对于20 μL的反应体系，模板DNA的加入量应控制在1~2 μL（10~200 ng/20 μL）之间。  01如果模板投入过少，可能会有以下影响检测灵敏度降低： 模板DNA量不足可能导致荧光信号的累积低于检测阈值，使得qPCR仪器无法准确检测到扩增信号。 Ct值偏大： 模板量少意味着需要更多的循环次数才能达到阈值，导致CT值变大。 定量准确性受影响： 模板DNA量不足可能导致计算出的目的基因表达量不准确，影响实验结果的可靠性。 实验重复性差： 当模板DNA量不足时，实验对各种条件（如反应体系的组成、操作过程中的微小变化等）变得更加敏感，随机误差放大。这意味着即使是微小的实验条件变化，也可能对实验结果产生较大影响。 02如果模板投入过多，可能会有以下影响：Ct值偏小： 由于模板量充足，扩增达到检测阈值的循环数减少。 非特异性扩增增加： 高模板浓度可能增加非特异性结合，导致非目标序列的扩增。 抑制聚合酶活性： 过多模板可能消耗反应体系中的必需离子，如镁离子，抑制酶活性。 荧光信号干扰： 可能影响荧光染料...

PCR产物纯化柱又双叒不够用了怎么办，能不用质粒纯化柱来替代使用呢？ 大部分实验室的buffer和纯化柱的数量不成正比，试剂盒中buffer过多，造成纯化柱相对短缺。其实，PCR产物纯化柱和质粒纯化柱是可以混用的。尽管它们主要用途不同，但它们的结构和原理类似，且均基于硅胶膜的吸附特性    分析  让我们先来看看纯化柱的结构和原理： 纯化柱有一层硅胶膜，材质是玻璃纤维的，能够能够选择性地吸附DNA和RNA，作用类似于一块过滤器。 在高盐浓度和低pH条件下，硅胶膜能够选择性地吸附DNA和RNA。而在低盐浓度和高pH条件下，DNA和RNA则会被释放出来。 硅胶膜的表面携带有大量修饰的硅羟基，在溶液中会解离，产生负电荷。当DNA或RNA与盐离子结合后，它们会与硅胶膜表面的硅羟基形成电桥，从而被吸附在硅胶膜上，而其他物质则被洗脱掉。 在PCR纯化过程中，加入binding buffer可以降低溶液的pH值，从而让DNA容易被吸附在硅胶膜上。 所以应该要使样本在加入柱子时，所处的溶液的pH值小于7。随后，使用的washing buffer中乙醇浓度不...

想要研究一个基因，应该如何下手呢？ 以较常见的肿瘤基因研究为例，给大家简单介绍一下主要步骤。 一确定研究基因！ 文献回顾与数据库搜索：通过查阅相关文献和数据库（如PubMed、TCGA、GEO等），确定在肿瘤中具有研究价值的基因A。 基因选择：优先选择未被广泛研究的基因，或者从已知研究中找到新的切入点。 基因功能预测：基于基因注释和现有研究，预测基因A可能的功能。    二体外实验（细胞实验） 基因编辑：使用CRISPR-Cas9、siRNA等技术对基因A进行敲除、敲低或过表达，以观察细胞表型的变化。 表型分析：分析细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭等生物学行为的变化，并通过多种实验方法（如流式细胞仪、划痕实验、Transwell迁移实验等）进行验证。 rescue实验：为了验证表型变化是由基因A直接引起的，可以进行rescue实验，即在敲除基因A的细胞中重新导入该基因，观察表型是否恢复。   三分子机制/信号通路研究 信号通路筛选：基于基因A的功能预测和已知研究，选择相关的信号通路进行筛选。 关键分子检测：通过Western Blot、qPCR等方...

蛋白质是由氨基酸组成，而氨基酸是由mRNA上的密码子（通常是3个碱基）编码的。因此，氨基酸的数量与编码蛋白质的基因中的碱基数目（或mRNA中的核苷酸数目）有直接关系。 但是，当我们说“蛋白大小”时，通常指的是蛋白质的分子量，而不是氨基酸的数量。 那么什么是蛋白质分子量呢？ 蛋白质的分子量（通常以kDa为单位）是蛋白质中所有原子质量的总和，包括构成它的所有氨基酸，以及其他可能存在的修饰基团（如糖基、磷酸基等）的质量。 所以仅仅用氨基酸数量去概括蛋白质大小是不对的。 为了快速估算蛋白质的分子量，经常使用一个平均的氨基酸分子量（如110 Da），来根据公式计算。 分子量＝氨基酸数目*110（平均分子量）/1000 举个例子：蛋白质有500个氨基酸 分子量 = 氨基酸数量 × 平均氨基酸分子量 ÷ 1000 = 500 × 110 Da ÷ 1000 = 55000 Da = 55 kDa 经过计算，可以得知，蛋白大小为55 kDa。 你搞清楚什么是蛋白大小吗？如果还不明白可以在留言区提问哦。 本篇文章来源于微信公众号:信天翁GOONIE...

在分子生物学研究中，RNA的提取是至关重要的一步，它直接影响到后续实验结果的准确性和可靠性。 对于不同类型的样本，如细胞、动物组织和血液，RNA提取过程中需要关注的细节和注意事项也各不相同。 动物组织 1、组织选取与保存： 因为RNA极易降解，所以首选新鲜组织进行RNA提取，同时保证组织块的清洁，没有血液、污物、粘液、食物、粪便等。 如果使用非新鲜组织，那么样本最好选择在-80℃冰箱或液氮中妥善保存且保存时间在三个月内的。 尽量避免组织的反复冻融，因为这同样会加速RNA的降解。 2、样本处理： 剪取组织时，避免组织长时间暴露于室温，应在冰盒上迅速操作，减少RNA降解的风险。 使用干净且经过消毒的剪刀和镊子剪取组织样本，确保从组织中央部位或新鲜切口处获取。 将剪下的组织充分剪碎，并立即放入无RNA酶的EP管中，加入适量的裂解液。确保剪碎的组织与裂解液充分接触，为后续匀浆做好准备。 3、组织量与裂解液匹配： 根据组织类型和成分调整剪取的组织量。对于含有大量蛋白、脂肪或紧密纤维组织的样本，比如肝脏，应适当减少组...

细胞凋亡（Apoptosis）是一个高度调控的细胞死亡过程，可以分为早期凋亡（Early Apoptosis）和晚期凋亡（Late Apoptosis）。 在凋亡过程中，细胞膜上的磷脂酰丝氨酸（PS）会从内侧外翻到外侧，外翻后细胞膜可以被Annexin V结合标记信号。同时，随着凋亡的进展，细胞膜不再完整，核酸染料因此可以进入细胞内标记DNA。 流式细胞仪的结果分析软件可以自动计算每个象限中细胞的比例，从而得出正常细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞和坏死细胞的比例。 Annexin V细胞凋亡检测试剂盒通常包含荧光标记物和核酸染料！荧光标记物在细胞凋亡的早期阶段，磷脂酰丝氨酸（PS）会从细胞膜的内侧翻转到外侧。Annexin V是一种与PS有高度亲和力的磷脂结合蛋白，通过将其与荧光素结合，如FITC、PE、AF647等，可以标记并检测这些外翻的PS，从而识别出早期凋亡的细胞。 1、 FITC（Fluorescein Isothiocyanate）： FITC是一种常见的绿色荧光标记物，具有较高的荧光强度和稳定性，适用于多种实验条件。 2、PE（Phycoerythrin）： PE藻红蛋白是一...

在细胞生物学研究中，准确快速地评估细胞活力和增殖状态是至关重要的。亲爱的研究生小伙伴们，你是否在实验室里埋头苦干，为了等待细胞增殖结果而心急如焚？传统的MTT法虽然经典，但其操作繁琐、耗时长，已逐渐被新一代的CCK-8法所取代。  今天，我们要介绍的Goonie超敏型CCK-8试剂盒，则是全新升级的版本。 CCK8原理简析WST-8检测原理 CCK-8（Cell Counting Kit-8）是一种基于WST-8的试剂盒，广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速、高灵敏度检测。WST-8在电子耦合试剂存在的情况下，被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色甲臜产物（formazan），其颜色深浅与细胞的增殖成正比，与细胞毒性成反比。 WST-8是MTT的一种升级替代产品，和MTT或其它MTT类似产品如XTT、MTS等相比有明显的优点。首先，MTT被线粒体内的一些脱氢酶还原生成的formazan不是水溶性的，需要有特定的溶解液来溶解；而WST-8和XTT、MTS产生的formazan都是水溶性的，可以省去后续的溶解步骤。其次，WST-8产生的formazan比XTT和...