qPCR中的Ct值：它是怎么来的？数值含义是什么？合理的Ct值是多少？

Ct值是怎么产生的？

在qPCR实验中，Ct值（Cycle Threshold，循环阈值）是指荧光信号达到仪器设定阈值时所经历的循环数。首先我们要知道qPCR本质也是DNA扩增的实验，只是仪器会在扩增的过程中，一边扩增一边记录产物产生的荧光信号。

具体地说，qPCR反应开始后，随着PCR循环的进行，目标DNA会不断扩增，荧光信号也会对应地逐渐增强。仪器在开始时会设定一个阈值，实时监测荧光信号的变化，并设定一个阈值。当荧光信号首次超过这个阈值时，仪器记录下此时的DNA扩增经历的循环次数，就是Ct值。

Ct值的数值含义是什么？

Ct值与样本中目标基因的起始拷贝数呈负相关关系。

• Ct值越小：说明样本中目标基因的DNA起始量越多，因为荧光信号用很少的扩增循环数很快就能达到阈值。
• Ct值越大：说明样本中目标基因的DNA起始量越少，需要更多扩增循环才能使荧光信号达到阈值。

两个样本同一个基因的孔的Ct值相差1代表什么？

我们来举例说明

假设有两个不同的样本需要检测基因GAPDH的表达

样本1测到的Ct值是15

样本2测到的Ct值是13

那就说明样本1的DNA需要复制15轮，荧光值可以达到仪器的阈值，而样本2则复制13轮就可以达到了，也就是说样本1和样本2的DNA初始量差了2轮扩增。而PCR扩增是2的指数形式扩增的，每扩增1轮，会增加2倍，扩增n轮，就会增加2^n。所以样本1和样本2相差的数量就是2^2=4倍。这就是为什么我们上期提到的计算基因差异表达的公式是2^(-ΔΔCt).

什么样的Ct值是合理的？

常规实验的Ct范围

理想区间：15 < Ct < 30 → 模板量适中，扩增效率高

可接受范围：Ct < 35 → 多数试剂在35循环后扩增效率显著下降

Ct < 10 → 可能模板过量导致抑制（需稀释样本重新检测）

Ct > 35 → 低拷贝检测，RNA可能降解了，需通过复孔验证特异性（避免假阳性）