WB转膜可以不用甲醇激活吗？
在生物化学与分子生物学研究中，Western Blotting（WB）技术作为研究蛋白质表达的关键手段，其步骤的精确性和试剂的选择对实验结果至关重要。传统的WB实验中，甲醇在转膜步骤中扮演着重要角色，尤其是用于PVDF膜的激活。然而，甲醇的使用也伴随着一系列局限性和健康风险。
WB实验流程图
①PVDF膜为什么要用甲醇激活？
PVDF（偏聚氟乙烯）膜因其优良的机械强度和蛋白质结合能力，在WB实验中广泛应用。然而，原始的PVDF膜是高度疏水的，不利于蛋白质在其表面的吸附和转移。甲醇激活PVDF膜的过程主要通过以下几个机制发挥作用：
去除生产残留物与污染物：甲醇能有效去除PVDF膜表面的生产残留物和储存相关的污染物，这些残留物可能会干扰蛋白质的有效转移和检测。
增加膜的亲水性：甲醇处理可以改变PVDF膜的表面特性，使其从疏水变为亲水。亲水性的增加有助于膜更好地吸附水基介质中的蛋白质，提高转膜效率。
去除SDS并改善蛋白质结合：SDS-PAGE电泳过程中，蛋白质表面包裹SDS分子。甲醇处理可以帮助去除这些SDS分子，促进蛋白质与PVDF膜的直接接触。
暂时减小膜孔径：甲醇与PVDF膜的聚合物链相互作用，暂时减小膜的孔隙，有助于防止小分子蛋白质在转膜过程中丢失。
②传统WB实验中的甲醇使用及其局限性
尽管甲醇在WB实验中表现出诸多优点，但其使用也伴随着一些不可忽视的局限性：
挥发性高，安全性差：甲醇具有较高的挥发性，其蒸汽具有刺激性气味，长期暴露会对实验人员的呼吸系统、眼睛和皮肤造成伤害。
环保压力大：甲醇的处理和废弃需要遵循严格的环保规定，增加了实验室的管理成本和环境压力。
潜在的蛋白质构象影响：在某些情况下，甲醇可能会影响蛋白质的构象，对后续的抗体识别和检测产生潜在干扰。
WB实验中膜激活和转膜液除了甲醇，其实还可以使用乙醇或者丙醇、乙二醇等。
③乙醇替代甲醇进行膜激活和转膜液的配制
乙醇替代甲醇的可行性
乙醇与甲醇在化学结构上具有一定的相似性，但在挥发性和毒性方面更为温和。实验证明，在WB实验的转膜步骤中，乙醇同样能够有效地促进蛋白质在膜上的吸附和转移。通过调整转膜缓冲液配方，将甲醇替换为乙醇，并对其他成分进行适当优化，可以获得与传统甲醇配方相当的转膜效果。
转膜液配制的优化
在《Comprehensive Optimization of Western Blotting》一文中，科研人员采用了半干转转膜电泳缓冲液配方，将甲醇替换为20%的乙醇，配方为Tris 36.9 mM，甘氨酸 39.1 mM，SDS 1.3 mM，20%乙醇，pH值保持在8.3。实验结果显示，乙醇组与甲醇组在蛋白质信噪比上无统计学差异，甚至在某些特定蛋白的检测中表现出潜在优势。
乙醇替代甲醇的其他优势
毒性低，安全性高：乙醇的挥发性和刺激性相对较低，对实验人员的健康危害更小。
环保合规，成本低：乙醇的处理和废弃相对简单，符合环保要求，降低了实验室的管理成本。
互动提问：大家做WB实验的时候，是使用甲醇还是乙醇进行激膜？
