qPCR扩增曲线荧光信号值很低怎么办？自救方法来了

做qPCR实验时，扩增曲线“躺平”、荧光信号低到怀疑人生？

一、模板篇：你的DNA/RNA可能“病了”

症状诊断

模板量不足：DNA浓度过低（<1 ng/μL）或样本体积不足时，仪器根本检测不到信号！

模板降解：反复冻融的RNA样本可能出现降解（电泳条带模糊），导致靶标序列破碎。

抑制剂污染：如血液样本中的血红蛋白、植物样本中的酚类物质，甚至残留的乙醇都可能“毒死”PCR酶。

急救方案

定量神器：用Nanodrop测浓度（A260/A280建议1.8-2.0），微量样本可用Qubit高精度检测。

降解抢救：-80℃分装保存RNA，避免反复冻融；DNA样本可加RNase A去除RNA干扰。

高频翻车现场

引物设计翻车：二聚体、非特异性结合，荧光信号被“无效消耗”。

探针“见光死”：荧光标记探针需避光保存，否则信号会“神秘消失”。

试剂盒过期：Taq酶失活、dNTP降解。

避坑指南

引物验证：新引物先跑PAGE胶确认条带特异性和扩增效率；做温度梯度PCR选择最佳Tm值。

探针保存：铝箔纸包裹、-20℃避光、分装使用。

试剂把控：新旧Master Mix平行实验对比。

三、仪器篇：设备可能“装睡”不干活！

诡异现象

同一批样本在A仪器信号正常，B仪器却很低？可能是滤光片老化或光路校准偏移！

荧光通道选错（比如SYBR Green误选成HEX通道），数据直接“消失”。

自救操作

校准三步走：运行仪器自带校准程序 → 用ROX参比染料校正孔间误差 → 定期更换老化滤光片。

通道双确认：软件设置界面截图存档，首次使用的探针务必核对波长匹配表。

四、终极排雷清单：从实验台到数据分析

建立阳性对照：用已知浓度质粒或标准品验证整个体系。

加样防漏口诀：模板最后加 → 贴壁滴加 → 离心 → 封膜按压。

耗材冷知识：非光学板可能会导致信号异常！选耗材认准“qPCR专用”标识。qPCR仪孔内脏污也会导致信号损失，建议使用白色的qPCR管去除环境影响。

你在qPCR实验中遇到过哪些“灵异”现象？欢迎留言吐槽~