流式实验如何选染料？怎么找通道？一篇全总结

做流式实验，是不是感觉像在玩一场超精密的“连连看”？想把不同的细胞标记都点亮，结果发现…… 染料选好了，仪器通道却对不上号？ 

或者，仪器配置单上写的都是“530/30”这种神秘代码，压根找不到“FITC通道”在哪？

别慌！这几乎是每个流式新手（甚至老手）都会遇到的“入门礼包”。

今天这篇，咱们就掰开揉碎了聊聊这个流式配色的问题：如何给你的荧光染料，在仪器上找到通道。

 一、先懂仪器再选染料

1、先懂仪器：

流式配色前，了解仪器配置（激光器，滤光片）

比如：

记录仪器的 激光器波长（如 405nm/488nm/561nm/640nm）

获取 滤光片参数表（例：APC通道 = 660/20nm 表示中心波长660nm，带宽20nm）

2、再选染料：

根据仪器可检测范围进行染料选择：弱表达抗原选择强荧光染料，强表达抗原选择弱荧光染料

也就是说，两种荧光染料是同一通道检测，则两者不适合同时使用，如BV421与eFluor450不适合同时使用。

 表格：常见的荧光染料表

二、 找不到对应名字的通道时候怎么选择？

假设手里有管染料（比如FITC），而仪器通道只标着数字和斜杠（比如“530/30”），咋办？下面教大家当仪器通道列表里没有染料的标准名称（如“FITC通道”）时，如何手动匹配通道？

实验前我们需要关注荧光素的激发波长和发射波长，以及流式细胞仪的激光器和滤光片参数。

我们需要了解仪器有几个激光，几个通道。

常见激光器有紫外激光（375 nm）、紫色激光（405 nm）、蓝色激光（488 nm）、绿色激光（532 nm）、黄绿激光（561 nm）、红色激光（637nm）。通道则因滤光片的不同而有所区别。不同品牌、不同型号配置会有所差异。

其中，激发波长和激光器决定了目的荧光素能否在特定配置的流式细胞仪上被激发，发射波长和滤光片参数决定荧光素的荧光能否在该流式细胞仪上被检测到。

通常来说，最大激发波长在激光器波长附近的荧光素一般都可以被激发；荧光素的最大发射波长落在滤光片的检测范围内时，其荧光可以被仪器检测到。

通过光谱图，我们可以很好地了解荧光素的波长信息，下面以FITC为例为大家进行讲解：

激发光谱（Excitation，Ex）

是指能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光线。其峰值称为激发波峰（最大激发波长，ExMax）。

发射光谱（Emission，Em）

是指某一波长激发光引起荧光素发射的一定波长范围内的荧光。其峰值称为发射波峰（最大发射波长，Em Max）。

一般来说，荧光发射光能量比激发光能量低，发射光波长比激发光波长长。荧光染料在激发波段中的最大激发波长处，能激发出最强的荧光，得到荧光素的激发波长，就可以选择相应的激发光源进行激发。知道荧光素的发射波长，就可以选择最大发射波长处相应的滤光片进行检测。

三、仪器没有最大发射波长（Em max）对应的滤光片怎么办？

我们在实际中可能会遇到一些荧光染料，其激发光谱波峰处远离自己仪器配置激光，以我们的PE荧光染料为例，由下面光谱图可知该染料的激发光谱波峰处明明在565nm左右，但为什么说用488nm激光检测呢？

PE荧光染料的最适激光是561nm激光（激发效率99%），而非488nm激光（激发效率49%），由于很多流式细胞仪并没有配置561nm激光，同时488nm激光也可以较好的激发该荧光素，因此488nm激光作为次优选择并没有问题。类似的案例还有7-AAD、DAPI以及PI等荧光染料。

解决办法：

1. 优先选择最接近的滤光片

原则：选择滤光片的中心波长与染料的Em max最接近的选项（通常允许±10-20 nm偏差）。

2. 避免光谱重叠

检查其他荧光染料的发射光谱是否与所选滤光片重叠。若存在重叠，需优先选择串色更少的滤光片（即使偏离Em max稍远）。

3. 参考荧光染料的发射光谱

若染料发射峰较宽（如PE-Cy5），可选择覆盖其发射曲线次高峰的滤光片（如Em max 670 nm，但可用660 nm或680 nm滤光片替代）。

 4.实验验证

单染对照：用替代滤光片检测目标染料的信号强度及背景，确认信噪比是否可接受。

补偿矩阵：在多色实验中，需重新调整补偿以消除串色。

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