为啥流式要先调电压？从零开始学流式：详解电压调节

流式实验主要步骤

实验前准备

根据实验需求选择合适仪器，准备过滤后的空白管、单染管和样本管，检查鞘液和废液桶状态

上机操作

按SOP开机，先用空白管调节FSC/SSC电压确定细胞群，再用单染管调节荧光通道电压并设置补偿，最后上样本管进行分析

实验结束

保存数据并备份模板，按SOP关机并维护液流系统

特别提醒一下流式小白，电压参数是必须在上机预览样本的时候才能调节，一旦采集记录数据，电压无法更改。

流式细胞仪的电压调节是实验中的关键步骤，直接影响荧光信号的检测灵敏度和数据准确性。这里说的调节电压其实是指光电倍增管（PMT）的电压。

流式仪器需要把细胞被激发的光信号转换成电信号，才可以被读取。这个过程就是由PMT来完成的。电压越高，单个光子转换成电子的数量就会越多，电压的调节会直接决定检测信号的强度。

当被荧光抗体标记的细胞进入流式细胞仪内通过激光束时，激发光会激发细胞上的荧光，从而产生相应的电压脉冲，这个脉冲的强度与PMT电压密切相关。

提高PMT电压可增强电流输出，从而放大信号增益，使弱荧光信号更易被检测。经过PMT转换的电信号需进一步放大才能被仪器分析处理。

流式细胞仪通常提供两种信号放大模式：

线性放大：

输入与输出信号呈线性关系，适用于信号变化比较小的样本，可以检测细胞DNA、RNA或总蛋白含量等指标。

对数放大：

输入与输出信号呈对数关系，适用于检测荧光通道，常用于检测细胞表面抗原表达。

简单的来说，调节电压的目的就是，不让细胞群“跑出”仪器的检测范围（避免信号堆积在边界或丢失）。“铺开”细胞群，让目标细胞在图中充分分散，与碎片或其他群体清晰区分，形成漂亮的、可分析的细胞群。

FSC信号：反映细胞体积

SSC信号：反映细胞颗粒度

这个调节主要是为了使细胞群集中在可视范围内。可以将细胞和碎片分开，避免碎片干扰。如果细胞体积比较大，可以通过调节这里的电压，保证细胞不会过于接近流式图的边界。

样本细胞/目标细胞位于流式图的中央，细胞群与细胞碎片分离

 每个荧光通道的电压需要单独优化，荧光通道的调节用峰图来判断会更准确。

阴性对照法：用未染色细胞或同型对照设定阴性群，阴性细胞群的信号应从基线（0附近）开始分布。

阳性信号优化：调节电压使阳性群与阴性群明显分离，避免信号饱和。阳性细胞群的峰值应比仪器的最大检测值低约一个数量级。

电压调节是补偿的基础，在流式实验中，电压和补偿的调节需要遵循顺序，先确定最佳的电压，后调节补偿。

因为荧光补偿的数值是基于特定电压下计算的，如果电压未确定，补偿值可能不准确。等补偿调节完成后，电压不可再次更改。当PMT电压过高时，荧光染料的激发效率增强，但光谱重叠也会更显著，导致补偿值异常。

此时需逐步降低相关通道的电压，减少信号溢漏，使阴性群与阳性群清晰分群。如果荧光补偿通道之间的电压差比较大，也可能导致补偿异常，这个时候需要平衡两个通道之间的电压来减少补偿。

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