由CRISPRCas9出发，一文带你了解热门基因编辑工具

CRISPR系统无疑是当今最具影响力的基因编辑技术之一。

它自出现以来，彻底改变了基因编辑的格局，为生命科学研究和基因治疗带来了前所未有的机遇。在此之前，虽然已有ZFN、TALENs等基因编辑工具，但CRISPR-Cas9的出现无疑将基因编辑技术推向了新的高度。经过数十年的研究与创新，科学家们已经开发出一系列功能强大且应用广泛的基因编辑工具。

从最初的 CRISPR-Cas9，到单碱基编辑系统，再到prime编辑系统，每一次技术突破都为生命科学研究和基因治疗带来新的希望。

我们今天就来了解一下热门基因编辑工具。

CRISPR的全称是Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats，中文名称是成簇的规律性间隔的短回文重复序列。而Cas则是一类蛋白的名字，这种蛋白的种类非常多，只是因为Cas9的应用比较广泛，人们提起Cas蛋白首先会想到Cas9蛋白。

天然的CRISPR-Cas系统其实是细菌用于抵抗外来入侵的免疫系统。当病毒入侵的时候，细菌会把病毒的基因序列复制记录下来，下次遇到相同的病毒的时候，细菌会转录产生对应的 RNA 与 Cas9 蛋白结合形成复合物，对病毒进行识别和剪切。所以到这里我们可以知道，CRISPR-Cas9系统的基本组成成分就是识别序列的sgRNA，以及具有核酸酶剪切活性的Cas蛋白。

CRISPR-Cas系统的sgRNA基本都是识别靶向序列的功能，但是在Cas蛋白上做文章，不同的蛋白不同的改造可以产生各式各样的基因编辑工具。

尽管新的编辑器层出不穷，CRISPR/Cas9仍然是应用最广泛的基因编辑工具。Cas9核酸酶包含RuvC和HNH两个结构域，在guide RNA引导下，可以识别并结合到目的DNA序列。但是Cas9蛋白对序列具有偏好性，目的序列附近必须存在PAM（Protospacer Adjacent Motif），即原间隔相邻基序。PAM由Cas9的种类决定，最常用的spCas9的PAM是NGG（5‘→3’）。

Cas9蛋白会切割双链，产生DSB（double strand break）双链断裂。细胞对于出现的DSB会启动修复程序，哺乳动物主要有三种修复方式，分别是：非同源末端连接（NHEJ）、微同源介导的末端连接（MMEJ）以及同源定向修复（HDR）。修复过程中可能会在序列上产生indel，即 insertion and deletion 插入和删除。

单碱基编辑器最早由哈佛大学David Liu实验室于2016年发表，指胞嘧啶碱基编辑器（CBE）和腺嘌呤碱基编辑器（ABE）。单碱基编辑器不会产生双链断裂，相对于CRISPR/Cas9系统更加安全。

CBE可以实现C→T胞嘧啶到胸腺嘧啶的替换，它由Cas9切口酶（nCas9）融合胞嘧啶脱氨酶（如rAPOBEC1）和尿嘧啶糖基化酶抑制剂（UGI） 构成，胞嘧啶脱氨酶将单链DNA上的胞嘧啶C脱氨基为尿嘧啶U,UGI抑制细胞内的碱基切除修复，防止U被修复为未编辑状态。细胞复制或修复过程中，U被识别为胸腺嘧啶（T），最终实现 C→T 的转换（或互补链上的 G→A）。

ABE可以实现A→G腺嘌呤到鸟嘌呤的替换，它由nCas9融合人工定向进化的腺嘌呤脱氨酶（如TadA变体）构成，ABE可以使单链上的腺嘌呤A脱氨基变为肌苷I，细胞会将肌苷I识别当成鸟嘌呤G，在后续的读码与复制中实现A→G的转换。需要注意的是，单碱基编辑器的nCas9仍然需要依赖近端有PAM序列的出现。

Prime Editors（PEs）是一种新型的基因编辑工具，同样是哈佛大学David Liu团队开发的，文章在2019年发表。PE的出现大大地扩大了基因编辑的可操作性，它不会引起DNA双链断裂，而且不需要额外引入修复模板，即可完成多种类型的基因编辑。

PE的组成部分包括H840A nCas9，逆转录酶 MMLV-RT和pegRNA（Prime Editor Guide RNA）。pegRNA除了包含guide RNA序列以外，还有一段引物结合序列（Primer binding site，PBS）和转录模板序列（RT template）。

PE在pegRNA的引导下在目的DNA产生单链断裂，断裂后被释放的DNA单链会与pegRNA上的Primer binding site结合，这一段序列将充当引物，在逆转录酶的催化下根据RT template逆转录出一段新的序列，随后被整合到原来的DNA序列中。

由此产生一段异质双链，一条链是原本的DNA序列，一条链是编辑后的序列，在后续的DNA修复和复制中形成新的被编辑好的双链，被保留在细胞中。

基于CRISPR的导向作用，科学家们又利用CRISPR/Cas9系统设计了转录激活的CRISPRa和转录抑制的CRISPRi技术

CRISPRa使用失活型Cas9（dCas9），这种dCas9不具备切割DNA链的能力，将dCas9与转录激活结构域比如P64, p65, Rta 和HSF1融合，sgRNA将其靶向至目的基因的启动子或增强子区域，实现增强目的基因的表达，CRISPRa已经改进发展出多种版本，例如CRISPRa v2 synergistic activation mediator (SAM)系统包含一个有MS2茎环结构的单向导RNA（sgRNA），这个sgRNA整合了两个MS2适配体，MS2蛋白招募转录激活因子p65和HSF1，从而实现更高效的转录激活。

CRISPRi由失活的dCas9蛋白与转录抑制结构域（如KRAB和MeCP2）融合而成，用于进行转录抑制的作用。在第一代CRISPRi构建体中，研究者将dCas9与锌指蛋白10的抑制结构域KRAB融合。后续为了提高效率，研究者将抑制结构域换成了锌指印迹蛋白3（ZIM3）中更强的KRAB。通过在KRAB基础上叠加其他抑制结构域（如MeCP2和SID4x），被发现可以进一步增强转录抑制的效果。

参考文献：

Villiger, L., Joung, J., Koblan, L. et al. CRISPR technologies for genome, epigenome and transcriptome editing. Nat Rev Mol Cell Biol 25, 464–487 (2024). https://doi.org/10.1038/s41580-023-00697-6