RNA提取浓度低，还能往下做逆转录和qPCR吗？

之前一期，我们介绍过，提取出的RNA浓度在哪些范围比较合适。

经常有一些小伙伴在后台问，提取出的RNA浓度很低，还能不能往下做逆转录和qPCR，今天给大家介绍一下。

以传统的trizol法提取为例，当RNA提取浓度低于预期（<20 ng/μL），建议从以下三方面排查：

1、样本因素

起始材料不足

穿刺组织、单细胞、体液游离 RNA 等样本因生物量低导致浓度不足，建议增加样本量或采用微量提取试剂盒。

样本降解风险

坏死组织、离体超 2 小时的样本内源 RNase 活性高，需取材后立即用 RNA 保护剂处理或液氮冻存。

2、操作因素

裂解不充分

肌肉、纤维组织等结构坚韧，常规研磨难以彻底破碎细胞，导致 RNA 释放不充分。需延长研磨时间，或采用机械研磨结合强效裂解液的方式。

沉淀不完全

乙醇沉淀时温度、时间不足，会降低 RNA 回收率，应确保在 - 20℃沉淀足够时间。

洗脱体积不当

洗脱体积过大直接稀释 RNA 浓度，推荐使用20- 30 μL 无酶水洗脱。

3、污染

耗材污染

普通塑料耗材表面可能残留 RNase，未经 DEPC 处理的水、枪头，RNase 活性可在 30 分钟内降解 90% 以上的 RNA。所有耗材必须为RNase - free。

操作污染

人体皮肤、唾液中富含 RNase，操作时未佩戴手套、频繁交谈，会引入外源 RNase。实验全程需佩戴无粉乳胶手套，且避免手套接触非实验物品；操作台用 75% 乙醇擦拭清洁。

4、储存不当

温度影响

4℃短期储存时间过长，RNA 会因水分子作用缓慢降解；-20℃长期储存若反复冻融（超过 3 次），RNA 断裂率增加 50%。

分装方式

未分装的 RNA 样本，每次开盖都会引入湿气与氧气，加速 RNA 氧化降解。建议根据实验用量精确分装，减少样本暴露次数。

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