RT-qPCR为什么一定要去除干净gDNA

在qPCR实验前清除RNA中的gDNA，主要是为了确保qPCR检测到的信号完全来自于目标RNA（cDNA），而不是被残留的gDNA所污染，从而保证定量结果的准确性和可靠性。

逆转录原理图

qPCR原理图

qPCR的目标：定量检测特定的cDNA序列，该cDNA是由我们感兴趣的mRNA通过逆转录而来的。

但是基因组DNA（gDNA）也包含我们所检测基因的序列。

如果RNA样品中混有gDNA：

qPCR的引物无法区分它们是要结合到cDNA上还是gDNA上。

引物会同时与cDNA和gDNA结合并进行扩增。

这样，最终检测到的荧光信号就是 “cDNA信号 + gDNA信号”的总和。

定量值假性偏高： 这是最直接的影响。检测的基因表达量会比实际值高，因为一部分信号来自于“背景噪音”gDNA。

数据失真，无法反映真实生物学差异： 假设你比较实验组和对照组的某个基因表达量。如果两个样品的gDNA污染程度不同（这在处理样品时很常见），那么你观察到的表达差异可能根本不是由真实的mRNA水平变化引起的，而是由gDNA污染程度的不同造成的。这会使得整个实验的结论失去意义。

灵敏度降低： 对于低丰度表达的基因，其cDNA本身信号就很弱。gDNA的背景信号会“淹没”掉微弱的真实信号，导致无法有效检测或定量这些基因。

结果不可靠，无法重复： 由于gDNA污染的程度在每个样品中可能不一致，实验结果会缺乏稳定性和可重复性。

一个常见的想法是：在设计qPCR引物时，让引物跨过一个内含子（即上游引物在一个外显子，下游引物在另一个外显子）。这样，从gDNA上扩增出来的产物会很大（包含内含子），而从cDNA上扩增的产物很小。通过优化qPCR条件，可以只检测小片段产物。

但这存在局限性：

单外显子基因： 对于没有内含子的基因，此方法完全无效。

假基因： 基因组中可能存在加工过的假基因，它们没有内含子，其序列与目标cDNA非常相似，引物同样会扩增它们，造成干扰。

无法完全避免非特异性扩增： 即使用跨内含子引物，在复杂的PCR反应中，仍有可能对gDNA大片段进行非特异性扩增，产生背景信号。

去除gDNA是更根本、更可靠的解决方案。

建议选用具有gDNA清除步骤的逆转录试剂盒：

很多逆转录试剂盒都包含了高效的gDNA去除步骤，推Fast First-Strand cDNA Synthesis Mix for RT（with dsDNase）货号500-101，配有高效去除gDNA的dsDNase。