大多数Oligo最终都是干粉形式，如果合成量足够多，能够在管子底部看到透明或类白色的薄片。通常建议配成浓度为100 μM母液保存，再稀释配制工作液使用。为什么不直接用母液去跑qPCR啊？

刚好最近客户就有这样的情况，一开始他就是直接用100 μM的引物去跑的，结果给大家看看。

100uM的引物跑的（20ul体系上0.4ul的引物F和引物R）

一开始看到这样的图，我们也没搞清楚，怎么回事。去到实验室了解之后，才发现是直接用母液跑的qPCR。经过调整，结果如下。

10uM的引物跑的（20ul体系上0.4ul的引物F和引物R）

当引物浓度过高时，引物分子之间（尤其是正向和反向引物之间）相遇并互补结合的概率大大增加，即使它们与模板DNA并不完全匹配。酶会以这种“引物二聚体”为模板进行延伸，生成短小的、非特异性的PCR产物。

原理：引物在低严谨性条件下（如退火温度并非最优时）可能会与模板DNA上相似但不完全匹配的序列结合。过量的引物加剧了这种错配结合的发生概率。

后果：除了目标片段，还会扩增出大小不一的非目标片段。这会消耗反应组分，降低目标产物的产量，并使定量结果（Ct值）严重失真。

原理：PCR反应体系中的各组分是经过精密优化的。过量的引物本身或其形成的引物二聚体，在高浓度下可能会对DNA聚合酶产生一定的抑制作用。

后果：目标基因的扩增效率会显著降低。一个理想的qPCR反应效率应在90%-110%之间（斜率约为-3.1到-3.6）。引物过量会导致效率远低于90%，使得定量结果不可信。标准曲线会变得平缓，灵敏度下降。

引物是实验成本的一部分。使用过量的引物不仅不会带来任何好处，反而是一种浪费。