货号：500-103

一、产品保存：

-15℃至-25℃保存一年，干冰运输。

二、 产品简介：

RNAflashTM DCA（Direct Cellular Amplification）one step RT qPCR （SYBR Green）kit 是一款快速、高效地从 “细胞”直接到“扩增结果”的 全套试剂盒，适用于 10 - 105 个培养细胞的基因表达分析。本产品无需传统提取繁琐的流程，可在细胞培养板中直接完成基因组 DNA 清除和 RNA 获取；搭配高效率、高稳定性、高特异性的一步法染料法 RT-qPCR 试剂，快至 52 min 即可从细胞中得到基因表达结果。本试剂盒操作便捷，可兼容广泛的细胞类型(贴壁和悬浮细胞)及细胞量，在提高效率的同时减少纯化过程中的样品损失，也可解决传统提取方式中低细胞数提取效果不佳的问题。本试剂盒可用于高通量(96/384 孔板)细胞 RNA 的表达分析。

三、产品特点:

普适性：多种细胞类型的基因表达分析，从 10个到 10⁵个常规培养细胞或稀有细胞，均可实现有效检测；

免纯化工艺：简化传统 RNA 提取流程，在培养孔内 5 分钟完成细胞裂解，7 分钟内完成 gDNA 消化，避免纯化造成的 RNA 损失；

高通量兼容：满足大规模细胞样本的平行处理需求，显著降低了高通量检测过程中的时间成本以及操作误差；

高效率：优化的一步法 RTqPCR 体系兼容裂解体系，最快检测仅需 52min。

四、产品组成:

• Lyse™ Buffer解冻后可于2~ 8℃条件下稳定存放1年。
• StopXtract™Buffer应避免反复冻融，需分装后置于-20℃。
• DCAOne-Step RT-qPCR Buffer Mix含dNTP Mix，Mg2+，热启动Taq酶、逆转录酶和荧光染料等，该组分在拆包装后需避光保存。

五、自备材料和试剂

ROX 校正染料， 1 × PBS 缓冲液、RNase-free ddH2O、RNase-free 吸头、1.5 ml RNase-free 离心管、0.2 ml RNase-free 八联排/PCR 管等。

六、实验工作流程图

七、实验流程

RNA获取

1、样本处理与准备

①贴壁细胞：

• 洗涤细胞：将不同孔板的贴壁细胞轻轻去除细胞培养基后，贴壁缓慢加入与培养基等体积的预冷的1×PBS洗涤，用移液器轻轻吸打8 - 10次，无明显细胞团即可；转移到离心管内，1000 rpm (930×g) ，4℃离心5 min收集至管底，缓慢去除PBS。 注意：去除培养基或PBS时动作应尽量轻缓，避免在清洗过程中造成细胞损失。
• 稀释细胞：根据实验需求(细胞数量测试的线性范围为10至105个)，用预冷的1 × PBS稀释细胞，将 稀释后的细胞悬液分装至200μL PCR管中，每管5 μL (保持细胞数在10 - 10^5个/管)，置于冰上备用。

②悬浮细胞：

• 去除培养基：将悬浮细胞转移至离心管中，1000 rpm (930 × g)， 4℃离心5 min收集至管底， 去除培养基。
• 洗涤细胞：加入预冷的1× PBS (尽量保证细胞密度处于2 ×104至2 ×106个/mL, 500 μL/105个细胞)，用移液器轻轻吸打8 - 10次，无明显细胞团即可；1000 rpm (930 × g) ，4℃离心5 min收集至管底，去除PBS。
• 稀释细胞：根据实验需求(细胞数量测试的线性范围为10至105个)，用预冷的1 × PBS稀释细胞，将 稀释后的细胞悬液分装至200μL PCR管中，每管5 μL (保持细胞数在10 - 10^5个/管)，置于冰上备用。

注意：去除培养基或PBS时动作应尽量轻缓，避免在清洗过程中造成细胞损失。

RNA获取

配制裂解工作液(200μL PCR管)

注意：裂解工作液按照孔板所需体积进行配制，各组分的比例为Lyse™ Buffer : DNase I : Purge™ Enzyme = 24 : 1。 配制完毕，颠倒混匀10 - 15次，避免剧烈涡旋振荡；混匀后置于冰上，请在1 h内使用。

• 向含有5μL细胞液的200 μL PCR管中加入50 μL裂解工作液，移液器轻轻吸打8 - 10次充分混匀，室温静置5 min 裂解细胞。
• 加入5 μL StopXtract™ Buffer，移液器轻轻吸打8 - 10次混匀，室温静置2 min终止反应。

注意：裂解产物可直接用于后续实验，如逆转录、一步法RT-qPCR及RT-PCR等。 裂解产物可置于冰上保存2 h，若需长期保存需置于-80℃。

一步法RTqPCR反应

配置反应体系

按下表 1 在冰上配制反应体系

注意：

• 将各组分置于冰上融解，轻微混匀离心后，加液顺序按照体系从多到少。
• 一般来说反应体系中引物终浓度为2μM 即可得到较好的扩增效果。当反应性能比较差时，可以在 0.1 - 1.0 μM 范围内调整引物浓度。
• 可根据检测需要，增加靶标个数。
• 扩增产物长度请选择在 100- 500 bp 范围内，尤其推荐 100 - 200 bp 之内。
• 若使用需要校正染料的 qPCR仪，则按照注意事项中建议的浓度投入到体系。

模板投入

向实验组的 PCR 反应管中分别加入 2-8 μL 细胞裂解液，使用 5 μL RNase-Free/ Nuclease Free H2O 作为无模板对照 （NTC 组），每组设置 3 个重复。

注意：投入 2-8μL 细胞裂解液，对扩增无抑制作用，细胞裂解液投入体积尽量不要低于 1 μL，避免吸液不准造成的误差。

反应程序

将反应体系轻轻混匀，并短暂离心，随后运行表 2 程序。

注意：5. 对于具有复杂二级结构或高 GC 区域的模板，将逆转录温度提高到 55℃，有助于提高扩增效率和灵敏度。逆转录时间可延长至 15 min，有助于提高 cDNA 产量。

No RT Control 反应(可选)

No RT Control 是指不加逆转录酶的逆转录阴性对照反应，用于检验 RNA 模板中是否有基因组 DNA残留。也可使用 Fast Taq SYBR Green qPCR Mix（货号 500-102）进行检测。

注意事项

• 按照注明的储存条件和要求对试剂储存，比如为避免StopXtract™ Buffer反复冻融，应对其分装后置于-20℃。
• 裂解细胞时，吹打时尽量轻柔，避免剧烈起泡。
• 一步法RT-qPCR(染料法)酶反应液含有高浓度的甘油，使用前请短暂离心，收集到反应管底部，并用移液枪轻轻吸打，充分混匀后准确吸取。
• 反应液的配制请使用RNase-free枪头，EP管等，尽量避免污染。
• 本制品中未配有ROXReference Dye，如果反应中需要添加ROX Reference Dye用以校正孔间荧光信号值误差，请根据仪器设备说明书要求确定是否添加ROX Reference Dye（一般需要高浓度ROX校正的仪器的ROX工作浓 度为4 μM；需要低浓度ROX校正的工作浓度为0.08 μM ,仪器见表3），ROX Reference Dye 产品在反应体系中建议50X稀释使用（例如，50μl反应体系中添加1μl ROX Reference Dye），如果实验结果不理想，可调整ROX Reference Dye添加量。