产品简介

EdU (5-Ethynyl-2’- deoxyuridine)是一种胸腺嘧啶核苷类似物，可以代替胸腺嘧啶(T)掺入到正在复制的 DNA 分子中，随后 EdU 与荧光染料发生快速的点击反应，新合成的 DNA 分子被荧光标记，通过检测荧光信号可快速检测细胞的增殖能力。

EdU 法无需使用抗体、操作简单、灵敏度高，是一种在 BrdU 法基础上升级的新方法。本试剂盒可用于培养细胞及组织切片的检测。

产品组分

备注：荧光光谱数据(Ex/Em)： 488 Azide：490/513 nm；555 Azide：550/561 nm；
594 Azide：585/609 nm；647A Azide：648/664 nm.
Hoechst 33342：346/460nm.

保存条件
本产品冰袋运输，4˚C 保存，一年内有效。注：Hoechst 33342 (试剂 F)，可分装后-20˚C 保存，短期内使用可保存于4˚C。荧光试剂注意避光使用。冰袋运输。

自备试剂
1. 10 mM PBS（pH7.2-7.6）
2. 细胞固定液（含 4%多聚甲醛的 PBS）
3. 透膜液（0.2% Triton X-100 in PBS）
4. 细胞培养板（48/24/12/6 孔板）；流式细胞分析管(如 12×75 mm)

注意事项

1. EdU 使用浓度说明：本试剂盒推荐使用 50 μM 的浓度孵育 2 小时，由于细胞类型、密度以及细胞增殖速度都会影响 DNA复制过程中 EdU 的掺入，因此建议首次实验时对 EdU 的最佳使用浓度进行优化，以达到更好的实验效果；同时，可设不加 EdU 的阴性对照组，以便进行染色背景分析。
2. 组织切片染色过程中需防止干片，干片会导致背景过强影响实验结果。
3. 试剂平衡至室温并瞬时离心再使用。
4. 为了您的安全与健康，实验过程中请穿实验服并佩戴口罩和一次性手套

使用说明（贴壁细胞）

细胞培养
每孔接种 0.5×10^5 ~1×10^6 细胞于 12 孔板中，细胞正常生长且密度不超过80%为宜。
EdU 标记

1.设置 1 个不加 EdU 培养基的阴性对照组，以便进行流式检测数据的染料背景分析。

2.用细胞培养基将 1000 X 的 EdU 溶液(试剂 A)稀释至 1X，制备适量 50 μM EdU 培养基。

注意： 1）EdU 浓度与孵育时间相关，短时间孵育育（<2h）宜采用高浓度（10~50 μM），长时间孵育（>24h）宜采用低浓度（10 μM）；

3.将细胞培养基更换为 EdU 培养基，每孔加入 0.5mL，孵育 2 小时。

注意： 1）最佳孵育时间与细胞周期相关（表 1），大多数肿瘤细胞系均可采用 2 小时孵育时间；
    2）EdU 培养基用量参考表 2；

备注：表 2 为贴壁细胞的使用量参考，悬浮细胞和组织切片的使用量适当调整

EdU 检测

1. EdU标记完成后，吸去培养基，用 PBS 洗涤细胞 1 次。
2. 每孔加入 5mL 的固定液，室温固定 10 分钟。注意：如果用于流式测试，则用胰酶消化之后再进行固定。
3. 去除固定液，用 PBS洗涤细胞 2 次。
4. 去除 PBS，每孔加 5mL 透膜液 0.2% TritonX-100 室温孵育 10 分钟。
5. 去除透膜液，用 PBS洗涤细胞 2 次。
6. 配制缓冲添加剂溶液：用 3mL 去离子水溶解一管缓冲添加剂(试剂 E)，混匀至全部溶解，即为缓冲添加剂溶液。配制后适当分装，并于-20ºC 保存。缓冲添加剂溶液在使用过程中如果出现变色成棕色，则弃用。
7. 参照表 3按顺序进行 EdU 反应液的配制：
8. 去除 PBS，每孔加入 500μL EdU 反应液，室温避光孵育 30 分钟。
9. 去除 EdU反应液，用 PBS 洗涤细胞 2-3 次。
10. 染核，用 PBS将 500X 的 Hoechst 33342(试剂 F)稀释成 1X 的染色工作液，每孔加入 5 mL 染色工作液，室温避光染色 5-10 分钟。
11. 去除染色工作液，用 PBS洗涤细胞 2 次。
12. 荧光显微镜检测。如果条件限制，请避光 4℃湿润保存，3天之内检测。

注意：按顺序配制适量 EdU 反应液 (现用现配，30 分钟内使用)

使用说明（组织切片）

动物体内EdU 的标记及切片样品的处理

a.动物体内 EdU的标记可参考相关文献。对于小鼠，可按照 10-200 mg/kg 的用量，把 EdU 用 PBS 配制成一定浓度，腹腔注射、特定组织或器官局部注射或者加入饮用水中，初次使用时建议对 EdU 的使用浓度进行一定的摸索。

b.标记4小时后或根据特定实验确定的适当时间后，取出所需的组织，按照常规步骤制作冰冻切片或石蜡切片。EdU标记的时间也可以参考相关文献自行调整。

c.对于冰冻切片：

可在组织周围用组化笔画圈，圈中滴加适量固定液，室温固定 15分钟。

去除固定液，用 PBS洗涤 2-3 次，每次 3 分钟。

去除 PBS，滴加适量透膜液室温孵育 10-15分钟。

去除透膜液，用 PBS洗涤 2 次，每次 3 分钟。

d.对于石蜡切片：

脱蜡：二甲苯脱蜡 5-10分钟，换用新的二甲苯脱蜡 5-10 分钟。无水乙醇 2 分钟，换新的无水乙醇 2 分钟。 90%乙醇 2 分钟。80%乙醇 2 分钟。70%乙醇 2 分钟。PBS 5 分钟。

去除 PBS，滴加适量透膜液室温孵育 10-15分钟。

去除透膜液，用 PBS洗涤 2 次，每次 3 分钟。

EdU 检测

1. 配制缓冲添加剂溶液：用 3mL 去离子水溶解一管缓冲添加剂(试剂 E)，混匀至全部溶解，即为缓冲添加剂溶液。配制后适当分装，并-20ºC 保存。缓冲添加剂溶液在使用过程中如果出现变色成棕色，则弃用。
2. 参照表3顺序进行 EdU 反应液的配制：
3. 去除 PBS，每个圈中滴加适量 EdU反应液，室温避光孵育 30 分钟。
4. 去除 EdU反应液，用 PBS 洗涤 3 次，每次 3-5 分钟。
5. 染核，用 PBS将 500X 的 Hoechst 33342(试剂 F)稀释成 1X 的染色工作液，每个圈中滴加适量染色工作液，室温避光染色 5-10 分钟。
6. 去除染色液，用 PBS洗涤细胞 2 次。
7. 用甘油或防荧光猝灭剂封片。
8. 荧光显微镜检测。如果条件限制，请避光于 4℃湿润保存，3天之内检测。