本试剂盒用于细胞凋亡的快速检测。在细胞凋亡早期，质膜内侧的磷脂酰丝氨酸(phosphotidylserine,PS)会外翻至细胞膜表面；而在凋亡的中后期，一些较大分子的化合物，如碘化丙啶(Propidium Iodide,PI,一种DNA结合染料)，可进入细胞将细胞核染上红色荧光。

Annexin V是一种Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与磷脂酰丝氨酸特异性结合。本试剂盒采用荧光染料AF647标记的Annexin V作为检测磷脂酰丝氨酸的探针，配合碘化丙啶(PI)，通过使用流式细胞仪、荧光显微镜或其它荧光检测设备，可以快速检测细胞凋亡。因此将Annexin V-AF647与PI进行共染，就可以区分不同凋亡时期的细胞。在双色流式细胞仪散点图上，Annexin V-AF647与PI双阴性为正常细胞，Annexin V-AF647阳性、PI阴性为早期凋亡细胞，Annexin V-AF647与PI双阳性为晚期凋亡细胞或坏死细胞。

产品组分

保存条件
本产品冰袋运输；避光保存于2~8℃，保质期12个月。Annexin V-AF647

和PI Solution需避光保存。

注意事项
1. Annexin V-AF647和PI染色前，不能用破坏细胞膜完整性的固定剂和穿透剂固定或穿膜。

2. 整个操作过程动作要尽量轻柔，请勿用力吹打细胞，避免对细胞造成机械性损伤。

3. 对于贴壁细胞，消化过程需注意：
1) 贴壁细胞诱导细胞凋亡时如有漂浮细胞，需收集漂浮细胞和贴壁细胞合并染色；
2) 胰酶消化时间过短，细胞需要用力吹打才能脱落，容易造成细胞膜的损伤，导致PI摄入过多；消化时间过长，细胞膜同样易造成损伤，甚至会影响细胞膜上PS与Annexin V-AF647的结合。
3) 尽量使用不含EDTA的胰酶，EDTA会影响Annexin V与PS的结合；如使用含EDTA的胰酶消化细胞，需要在染色之前用PBS洗涤细胞两次以去除EDTA。

4. 如果样品来源于血液，请务必除去血液中的血小板。因为血小板含有PS，能与Annexin V结合，从而干扰实验结果。可以使用含有EDTA的缓冲剂并在1500 rpm(200×g)离心洗去血小板。

5. Annexin V-AF647和PI是光敏物质，在操作时请注意避光。

6. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

检测方法
(一) 样本染色-悬浮细胞
1. 离心收集所需细胞(1500 rpm,5min)；
2. 加入预冷的PBS轻柔重悬细胞，离心收集细胞，共洗涤两次；
3. 用去离子水将10×Binding Buffer稀释至1×Binding Buffer，再用1×Binding Buffer重悬细胞，调整细胞浓度为1-5×10^6cells/mL；

▲流式检测需设置三个对照样品来调节电压和补偿：
空白管：仅用1×Binding Buffer重悬的细胞，以评估自身荧光水平，并调整仪器电压；

单染管：分别用Annexin V-AF647或碘化丙啶(PI)染色，用于调节荧光通道的补偿。

4. 吸取100 μL细胞悬液(细胞总数为1-5×10^5 cells)至一新EP管中，加入5 μL Annexin V-AF647，轻柔混匀；再加入5 μL碘化丙啶(PI)，轻柔混匀，室温避光孵育10~15 min；
5. 加入400 μL1×Binding Buffer，轻柔混匀。染色后样品尽量在1 h内用流式细胞仪检测。

(一) 样本染色-贴壁细胞
1. 将细胞培养液吸出至一新离心管内，接着用预冷的PBS轻柔洗涤贴壁细胞一次。加入可以覆盖贴壁细胞的胰酶消化液，轻摇使胰酶与细胞充分接触，室温消化适当时间，轻轻吹打可以使贴壁细胞脱落下来即可；
2. 在细胞中加入上一步骤收集的细胞培养液，稍混匀，转移至离心管内，离心(1500 rpm,5min)，弃上清，收集细胞；

3. 加入预冷的PBS 轻柔重悬细胞，离心收集细胞，共洗涤两次；
4. 用去离子水将10×Binding Buffer稀释至1×Binding Buffer，再用1×Binding Buffer重悬细胞，调整细胞浓度为1-5×10^6cells/mL；

▲流式检测需设置三个对照样品来调节电压和补偿：
空白管：仅用1×Binding Buffer重悬的细胞，以评估自身荧光水平，并调整仪器电压；

单染管：分别用Annexin V-AF647或碘化丙啶(PI)染色，用于调节荧光通道的补偿。

5. 吸取100 μL细胞悬液(细胞总数为1-5×10^5 cells) 至一新EP管中，加入5 μL Annexin V-AF647，轻柔混匀；再加入5 μL碘化丙啶(PI)，轻柔混匀，室温避光孵育10~15 min；
6. 加入400 μL1×Binding Buffer，轻柔混匀。染色后样品尽量在1 h内用流式细胞仪检测。

样品分析

AF647 最大激发波长为 651 nm，最大发射波长为 665 nm；PI-DNA 复合物的最大激发波长为 535 nm，最大发射波长为 615 nm，PI 的红色荧光在 FL2 或 FL3 通道检测，建议使用 FL3。

1. 假阳性

阴性对照(未经凋亡诱导的细胞)染色后Annexin V-AF647/PI双阳性比例过高，其原因可能是细胞本身活力低，因此建议

用台盼蓝染色计算细胞活力，阴性对照台盼蓝阳性的细胞比例应小于5%。若细胞活力低，建议换用其他细胞或重新复

苏细胞，新复苏的细胞应传代1-2代以后进行实验。

2. Annexin V-AF647染色失败或者阳性率偏低。

首先需要确定实验中所用的凋亡诱导剂是否能产生凋亡。可通过设立阳性对照组来确定(诱导效果确定的阳性药物处理

细胞)。Annexin V-AF647染色失败，最常见的操作原因是贴壁细胞消化不当。Annexin V跟PS的结合需要Ca2+，

Binding Buffer中含有Ca2+，含EDTA的胰酶消化会影响染色。

用PBS洗涤细胞沉淀后，应尽量去除残余液体。残留PBS中的磷酸根，会形成磷酸钙沉淀。

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